HMGB(高遷移率族蛋白B1) zui近被認(rèn)為是內(nèi)毒素的晚期致命因子介質(zhì)，并被普遍認(rèn)為是一種炎癥介質(zhì)，在急性的臨床炎癥疾病中起到至關(guān)重要的作用。

HMGB1 蛋白由216個(gè)氨基酸組成， 小鼠、大鼠、牛、及人99% 的HMGB1氨基酸序列是相同的。HMGB1蛋白由三個(gè)結(jié)構(gòu)域組成。分別為“A Box (氨基酸序列：9-85)”、B box(氨基酸序列：88-162)和一個(gè)帶負(fù)電荷的羧基端（氨基酸序列：186-216）。此外，B-box 參與炎癥反應(yīng)活性而A Box 則被認(rèn)為是作為一個(gè)拮抗劑的功能。

許多證據(jù)表明HMGB在炎癥反應(yīng)免疫應(yīng)答中發(fā)揮的重要性。例如，已有研究表明，HMGB可以有許多細(xì)胞主動(dòng)分泌，例如：巨噬細(xì)胞被LPS ,TNF 和IL-1 刺激后，主動(dòng)分泌HMGB1蛋白，也可由壞死細(xì)胞被動(dòng)釋放。事實(shí)上，感染性休克死亡的病人血清中的HMGB1蛋白水平高于敗血癥病人。同樣，在敗血癥動(dòng)物模型及膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型血清中，也可檢測(cè)到高水平的HMGB蛋白。關(guān)于這個(gè)蛋白的功能，HMGB1蛋白被認(rèn)為起到促進(jìn)細(xì)胞釋放TNF和IL-1 細(xì)胞因子的功能及與LPS結(jié)合協(xié)同增加外周血單核細(xì)胞產(chǎn)生IL-6。總之，這些現(xiàn)象表明，HMGB1在炎癥反應(yīng)中起到重要作用。

Chondrex 公司提供捕獲ELISA kit,用于檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清及小鼠血清中的HMGB1水平。試劑盒包含標(biāo)準(zhǔn)品及足夠的試劑用于檢測(cè)40個(gè)樣品（復(fù)孔）

試劑盒組成

注：

1. 推薦樣品和標(biāo)準(zhǔn)品都進(jìn)行復(fù)孔檢測(cè)。
2. 剩于的捕獲抗體、檢測(cè)抗體、鏈親和素需儲(chǔ)存于-20°C。
3. 20X的洗液（Wash buffer）低溫儲(chǔ)存會(huì)結(jié)晶。如果有結(jié)晶，將Wash buffe 置于水浴中溫育，直至晶體全部溶解。
4. 緩沖液稀釋前用移液器測(cè)量的準(zhǔn)確體積。（提供足夠的緩沖液）。
5. 該試劑盒可用于檢測(cè) 小鼠血清和細(xì)胞培養(yǎng)上清中HMGB1蛋白水平。用于分析人的血清HMGB1水平時(shí)，應(yīng)特別注意。因?yàn)橐延醒芯繄?bào)道，有自身免疫疾病的病人產(chǎn)生的針對(duì)HMGB1的抗體在血清中占9-89%。這些血清中的多抗的存在，封閉了HMGB1抗原表位，從而影響試劑盒中捕獲抗體和檢測(cè)抗體對(duì)HMGB的結(jié)合。因此，在使用試劑盒之前對(duì)病人的疾病背景了解，至關(guān)重要。

操作程序：

1 加入捕獲抗體：將捕獲抗體（100ul）用10ml 溶液A 稀釋后，每孔加入100ul稀釋液，

4℃ 孵育overnight。

2 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液的準(zhǔn)備：推薦的標(biāo)準(zhǔn)品濃度梯度為：1.6-100ng/ml。在標(biāo)準(zhǔn)品（1瓶）中加入950ul稀釋液溶液B，則終濃度為100ng/ml。取250ul 100ng/ml稀釋液加入250ul溶液 B,則終濃度為50ng/ml。依次類推，重復(fù)5次，依次分別配成25 ng/ml，12.5ng/ul,6.25 ng/ml,

3.1 ng/ml,1.6ng/ml的稀釋液。100ng/ml 的儲(chǔ)存液不能夠在后續(xù)試驗(yàn)中應(yīng)用。倒掉多余的剩余標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液。推薦在每次試驗(yàn)時(shí)用新鮮的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液。

3 樣品稀釋液的準(zhǔn)備：4℃1000 rpm離心3min 去除一些不溶物和脂類物質(zhì)，取上清作為試驗(yàn)樣品。如果HMGB1蛋白水平超過100ng/ml，請(qǐng)配置更高的稀釋度的樣品稀釋液。

4 檢測(cè)抗體的準(zhǔn)備：用5ml溶液C稀釋檢測(cè)抗體（1瓶）

5 洗脫緩沖液的稀釋：用950ml 蒸餾水稀釋50ml 20x洗脫儲(chǔ)存液，配成1x 洗脫液。用1x 洗脫液至少洗版3次（或用自動(dòng)洗版機(jī)）。甩去液體，倒扣板，置干凈的吸水紙上，去除多余的液體。不要讓板子*變干。

 6 加入標(biāo)準(zhǔn)品，樣品和檢測(cè)抗體：混勻標(biāo)準(zhǔn)品，檢測(cè)樣本和檢測(cè)抗體。按圖1，空白孔加入50ul 溶液B，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品加到對(duì)應(yīng)的孔中。加入50ul 稀釋的檢測(cè)抗體到各孔，用移液器（或振蕩儀）上混勻檢測(cè)抗體稀釋液和標(biāo)準(zhǔn)品/樣品稀釋液。用封板膜封板，37 ℃孵育1小時(shí)，此后4 ℃ overnight。

7 鏈親和素的稀釋：用10ml溶液D稀釋鏈親和素（1瓶）

8 洗滌：用1X 洗滌緩沖液洗板3次（至少）。甩去液體，倒扣板，置干凈的吸水紙上，去除多余的液體。不要讓板子*變干。

9 加入鏈酶親和素：每孔加入100ul 鏈酶親和素稀釋液，室溫孵育30min。孵育時(shí)間不要超過1小時(shí)。

10 洗滌：用1X 洗滌緩沖液洗板3次（至少）。甩去液體，倒扣板，置干凈的吸水紙上，去除多余的液體。不要讓板子*變干

11 TMB：洗滌后，立即每孔加入100 ul TMB。室溫孵育30min。

12 終止：每孔加入50ul 終止液。

13 讀數(shù)：30分鐘內(nèi)讀取450nm 和 630nm 雙波長(zhǎng)OD值。

計(jì)算樣品中HMGB1濃度

1 計(jì)算空白孔、標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的OD平均值。

2 計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的OD平均值減去空白孔的平均OD值。

3 HMGB1的濃度作為橫坐標(biāo)，OD的lg值作為縱坐標(biāo)，做曲線。圖2,示典型的HMGB1濃度從1.6ng/ml 到100ng/ml 標(biāo)準(zhǔn)曲線。