佐劑誘導的關節炎（AIA）

背景介紹

1956年，Pearson 發現用*佐劑免疫大鼠可誘發關節炎。這種關節炎模型，被稱為佐劑誘導的關節炎，被廣泛用作關節炎研究的動物模型。AIA 也可用其他的其他細菌誘導：比如丁酸、表皮葡萄球菌等。Kohashi等研究發現：肽聚糖是這些細菌細胞壁中共同的致病因素，肽聚糖衍生物MDP中具有較低的致病性。

通過引入關節炎大鼠的T細胞（不是血清抗體）可以再正常的大鼠誘導關節炎。關節炎性T細胞識別結合菌65kDa熱休克蛋白的抗原表位（180-188殘基），這個表位結構與結蹄組織中蛋白聚糖連接態的結構相同。這表明，T細胞對自體成分有免疫應答，有助于誘發關節炎。

備注：

以前，AIA被用作關節炎研究的動物模型，但這種關節炎被認為是反應性關節炎而不是真正的關節炎。研究表明：AIA動物模型與真正的關節炎在組織學和免疫學特征上是有區別的。AIA模型用于外部因素激發的導致的自身免疫應答機制研究。

實驗動物供應商

即使是同一品系，不同供應商提供的大鼠在遺傳背景上和菌群上也不同。這種差異導致實驗結果上的差異。Chondrex 推薦客戶在批量實驗前，先做預實驗，比較不同供應商實驗動物的差異。

室內條件

環境因素的影響對于AIA模型也非常重要。比如：無菌的Fisher 344(F344)大鼠對AIA非常易感，SPF動物條件和常規的動物條件， 會產生嚴重的關節炎。傳統的動物條件也會誘發F344大鼠發生關節炎，但是嚴重程度和發病率要相對低于20%。

大鼠品系和日齡

Lewis、SD、Wister 及BN大鼠被認為是AIA誘導的易感品系。 BUF、F344及糖尿病大鼠是中度和輕度的易感品系。易感性因動物供應商、免疫劑量及分枝桿菌的來源和制備方法的不同而不同。推薦6-12周齡的大鼠用于誘導AIA模型。大鼠幼鼠（1-7日齡）不易感，而老齡鼠（≥9個月）相對抗性太強。

注：Dark agouti(DA)大鼠對AIA（*佐劑誘導），CIA（膠原誘導）,OIA(不*佐劑誘導)的關節炎都非常易感。這個品系的關節炎病理機制與其他品牌誘導的AIA模型可能是不同的。因此，如果用DA大鼠誘導AIA模型做研究比較復雜，需要考慮更多的影響因素。

           常用的誘導AIA動物模型的品系

佐劑

A.油劑類型

礦物油的來源也是影響AIA造模的關鍵因素。弗氏不*佐劑（cat7002#）常被用于相應的油劑，但是可用于生物降解的植物油，例如：橄欖油也可以用作佐劑。有報道表明用海鮫油劑誘導低敏感性的F344大鼠非常有效。但在實際應用中，礦物油，海鮫油，液體石蠟對于誘導易感品系的大鼠具有相同的效果。

B.結核桿菌

不同來源的分枝桿菌分離出的肽聚糖、胞壁酰二肽（MDP），都被用作抗原誘導AIA.。滅活的分枝桿菌顆粒大小是影響AIA造模的重要因素。小的顆粒相比大顆粒或聚合物具有更好的免疫原性。為了有效誘導AIA模型，推薦結核桿菌濃度至少5mg/ml。 10mg/ml(cat#7027)被廣泛應用于AIA模型誘導。

注：1mg/ml 的*佐劑，由于結核桿菌濃度太低，很難有效誘發AIA模型。

免疫方法

通過單次尾根部皮下注射，對易感品系很容易誘發AIA動物模型，對于一些不敏感的品系，佐劑需要進入淋巴系統才能產生免疫應答。研究表明，對于F344這種不敏感的品系，淋巴系統免疫佐劑比常規足墊免疫誘發AIA更有效。

每次免疫前都需要重懸佐劑，保證結核桿菌混勻，如果沒有重懸，佐劑中的結核桿菌分布不均勻。

注：乳化佐劑

AIA模型不需要對佐劑進行乳化。但是為了避免出現結核桿菌分布不均勻的問題，*佐劑常與生理鹽水或緩沖液等體積制備乳劑用于誘導AIA。有報道用*佐劑與肽聚糖或MDP混合制備乳劑誘導F344大鼠的AIA模型。關于乳劑的制備方法，請參考A部分“乳劑制備操作流程”

佐劑誘導的關節炎操作流程（AIA）

A.佐劑制備

Chondrex公司提供10mg/ml （cat#7027）和20mg/ml(cat#7024)，在注射之前混勻佐劑，確保結核桿菌均勻分布。

B．注射

選擇足底免疫還是尾根部免疫取決于具體的研究目的。

1.足底免疫

后爪足墊皮下免疫0.05ml *佐劑(cat#7027 10 mg/ml)。針頭應插入足墊皮下指向腳踝方向：這樣能夠保證佐劑引流到淋巴結。30min內會看到嚴重的急性炎癥反應，高峰期3-4天，通常情況下回持續20-25天。免疫的后爪不能作為評分標準，因為即使其四肢都沒有腫脹，免疫的后爪也會發生腫脹。

免疫后12-14天在未注射的爪子發生腫脹，高峰期2-3天，關節炎會持續20-25天。但是有一些大鼠會反生由骨膜反應引起的慢性骨性肥大。

2.尾根部免疫

尾根部皮下免疫0.05ml *佐劑(cat#7027 10 mg/ml)。這種方法的有點是能夠使4只爪子都發生腫脹。免疫后12-14天在爪子發生腫脹，關節炎會持續20-25天。

注：如果用（cat#7024 20 mg/ml）佐劑免疫，注射體積應降低一半。

            圖1.尾根部皮下免疫

C．關節炎評估

1）評分：

關節炎嚴重程度可以通過外觀評分。10-25天，通過日常觀察，評估疾病的發展進程。如果采取尾根部免疫，四肢都要做評分（0-4分）：0分：正常 1分：中度關節炎 4分：嚴重的關節炎。尾根部免疫關節炎評分高分為16分（4只爪總分），如果采取足墊免疫評分高為12分（免疫的爪不做評分）。除每日評分外，在實驗結束后，記錄每個爪的評分。后者反應了關節炎的炎癥的加重程度，特別是前后爪發病不同步的時候。

2）足趾厚度和體積評估

足趾腫脹也可以通過測定足趾厚度和體積進行評估，可以采用足趾測量儀或體積測定儀進行測定評估。

3）局部熱療評估

局部熱療評估是是非常準確的檢測炎癥程度的指標，這種方法操作簡單且非常靈敏。可以用：接觸式溫度計測量爪子表面溫度。

                         圖2.AIA模型的抗炎癥藥物評估

用0.05ml 10mg/ml的佐劑誘導的SD大鼠的AIA模型。0-20天每天口服抗炎癥藥物（E-5110: 3 mg/kg)。通過測定1-20天，后爪（左）的炎癥和14-20后爪（右）炎癥反應評估藥物效果。紅色：對照大鼠 紫色：藥物處理的大鼠。

參考文獻

1. C. Pearson. Development of arthritis, periarthritis and periotitis in rats given adjuvant. Proc Soc Exp Biol Med 1956;91:95-101.

2. Kobashi O, Pearson CM, Beck FW, Narita T, Kotani S.Arthritogenecity in rats of cell walls from several Streptococci,Staphylococci and two other bacteria. Proc Soc Exp Biol Med 1976;152:156-60.

3. Best R, Christian R, Lewis DA. Effect of particle size of dried mycobacteria on adjuvant induced arthritis in the rat. In?ammation Res 1984;14:256-68.

4. Kohashi O, Kuwata J, Umehara K, Uemura F, Takahashi T,Ozawa A. Susceptibility to adjuvant-induced arthritis among germfree, specific-pathogen-free, and conventional rats. Infection

& Immunity 1979;26:791-4.

5. Kohashi O, Pearson CM, Watanabe Y, Kotani S, Koga T. Structural requirements for arthritogenecity of peptidoglycans from Staphylococcus aureus and Lactobacillus plantarum and

analogous synthetic compounds. J Immunol 1976;116:1635-39.

6. van Eden, W Thole JE, van der Zee R, et al. Cloning of the mycobacterial epitope recognized by T lymphocytes in adjuvant arthritis. Nature 1988;331:171-3.

7. van Eden, W Holoshitz J, Nevo Z, et al. Arthritis induced by aT-lymphocyte clone that responds to mycobacterium tuberculosis and to cartilage proteoglycans. Proc Natl Acad Sci USA

1985;82:5117-20.

8. Lorentzen JC. Identification of arthritogenic adjuvants of self and foreign origin. Scan J immunol 1999;49:45-50.

9. Kohashi O, Pearson CM, Beck FW, Alexander M. Effect of oil composition on both adjuvant-induced arthritis and delayed hypersensitivity to purified protein derivative and peptidoglycans in various rats strains. Infec Immun 1977;17:244-9.

10. Cremer MA, Towns AS, Kang AH. Adjuvant-induced arthritis in rats. Evidence that autoimmunity to homologous collagen types I, II, IX and XI is not involved in the pathogenesis of arthritis. Clin

Exp Immunol 1990;82:307-12.

11. Whitehouse MW. Adjuvant-induced polyarthritis in rats. Handbook of animal models for the rheumatic diseases. CRC Press 1988;1:3-

12. Shirota H, Kobayashi S, Shiojiri H, Igarashi T. Determination of in?amed paw surface temperature in rats. J Pharmacol Methods

1984;12:35-43.

13. Shirota H, Goto M, Katayama K. Application of adjuvant-induced local hyperthermia for evaluation of anti-in?ammatory drugs. J Pharmacol Exp Ther 1988;247:1158-63.

14. L. Bevaart, M. J. Vervoordeldonk, P. P. Tak, Evaluation of therapeutic targets in animal models of arthritis: How does it relate to rheumatoid arthritis? Arthritis & Rheumatism 2010;62:2192–2205.

15. O. Kohashi et al., Susceptibility to adjuvant-induced arthritis among germfree, specific-pathogen-free, and conventional rats. Infect. Immun 1979;26:791–794.