谷氨酸脫羧酶抗體酶聯免疫測定試劑盒

更新時間：2013-06-19

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使用說明書

體外診斷試劑

2005年2月7日

谷氨酸脫羧酶抗體酶聯免疫測定試劑盒

-96人份檢測-

試劑代碼 3802

酶聯免疫法檢測人血清中

谷氨酸脫羧酶的自身免疫抗體（GAD6bs）

MEDIPAN GMBH

MEDIPAN GMBH 非放射分析試驗圖標使用說明

體外診斷試劑

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遵照使用說明

存儲于

生物學危險品

微量包被盤

清洗緩沖液

酶結合物

底物

終止液

酶結合物稀釋液

起始緩沖液

起始稀釋液

質控血清

標準品

有的生產許可證包括US 5,512,447 和 EP 0502188.

用途

I 型糖尿病又稱胰島素依賴型糖尿病（IDDM），主要由于分泌胰島素的胰腺β細胞的慢性自身免疫性損傷所致。很可能是由于環境因素作用與易感基因缺陷人群，而誘發此病。當胰腺β細胞的80-90%被損傷時，臨床狀況才出現。在*癥狀出現前，這個細胞損傷的程序可能要持續好幾年，并且此病可發生在任何年齡及任何時間。

在臨床癥狀出現前的階段，針對于β細胞抗原的自身抗體出現在血液循環中，預示著此類疾病的出現。象胰島素抗體（IAA），谷氨酸脫羧酶（GAD抗體和酪氨酸磷酸酶抗體（又稱ICA512或IA2抗體）這些自身免疫抗體，在I型糖尿疾病初發或臨床癥狀出現前就已經存在多年。GAD是一種催化谷氨酸轉化為GABA的酶，GAD已經被識別有2種分子量分別為65.000（GAD₆₅）和67.000（GAD₆₇）的同工酶。盡管GAD自身抗體被發現在I型糖尿病患者和極少數的神經紊亂Stiff-man綜合癥（SMS）患者體內，但GAD自身抗體在此2種病患者體內的連接形式是不同的。

SMS患者體內的自身抗體識別一種線性的和三維空間的結構GAD抗原，而在I型糖尿病患者體內的GAD₆₅自身抗體只識別三維結構的抗原。在近期的患者診斷中，在70-80%的I型糖尿病患者體內可檢測出GAD₆₅自身抗體（GAD₆₅ Abs）。

GAD65自身抗體和IA2自身抗體的聯合檢測對于兒童和成人的I型糖尿病危險性的評估有很好的相關性。

ANTI-ICA與ANTI-GAD聯合檢驗比單獨使用ANTI-ICA診斷I型糖尿病更加敏感，更有判定性，比如在I型糖尿病的檢測方面。

GAD也出現在一些II型糖尿病病人中，患者多有顯著的高血糖。患者在接受口服降糖藥物治療幾個月甚至幾年后，他們可能會變成胰島素依賴型患者。因此，此類病人被認為是一種漸進型的I型糖尿病患者。我們常稱這種疾病為隱性疾病或成人隱性自身免疫疾病。

此類病人血清中的GAD65抗體的存在是將來胰島素依賴性的一個敏感和特異的標志。

參考文獻

- Batstra M, Anstoot H, Herbrink P: Prediction and diagnosis of type 1 diabetes using ß-cell autoantibodies. Clin Lab 2001; 47:497-507

- Seissler J,.Hatziagelaki E, Scherbaum WA: Modern concepts for the prediction of type 1 diabetes. Exp Clin Endocrinol Diabetes 2001; 109 Suppl 2: S304-S316

- Pozzilli P, Manfrini S, Monetini L: Biochemical markers of type 1 diabetes; clinival use. Scand J Clin Lab Invest 2001;61:38-44

- Schernthaner G, Hink S, Kopp HP et al.: Progress in the

characterization of slowly progressive autoimmune diabetes in adult patients （LADA or type1,5 diabetes）. Exp Clin Endocrinol diabetes 2001; Suppl 2: S94-S108

- Winter WE, Harris N; Schatz D: Immunological markers in the diagnosis and prediction of autoimmune Type 1a diabetes. Clinical Diabetes 2002; 20: 183-191

試驗原理

谷氨酸脫羧酶抗體檢測試劑是一個酶聯免疫方法的分析試驗，用于定量檢測人血清內的谷氨酸脫羧酶自身免疫抗體（GAD₆₅ Abs）。

本試驗體系利用GAD₆₅抗體的二價性，在固相的GAD65和液相的GAD65-生物素之間形成一個橋。首先，來自于樣本的GAD₆₅抗體結合到包被有GAD₆₅的微孔盤上。其次，GAD₆₅-生物素結合到這個復合物上。這個結合上的GAD₆₅-生物素的量與樣本中的GAD₆₅抗體的含量相關。未結合的GAD₆₅-生物素通過清洗被去除。結合的GAD₆₅-生物素可通過加入的鏈霉素過氧化酶來定量，再加入呈色底物（TMB），zui后在波長450nm下讀取光密度。

病人樣本

樣本的收集和保存

通過靜脈取血。血液凝集后，通過離心分離血清。必要使用脂血或嚴重溶血的血清樣本。不可以使用血漿檢測。

樣本可在2-8^oC保存zui多3天，長期保存要求放置于-20^oC。

避免反復凍融血清樣本。如果要多次使用，在zui初使用時將樣本等量分配為幾分，保存于-20^oC。

試劑組分

A	微孔盤 12 x 8 可折，包被人類重組GAD₆₅	真空密封，內附干燥劑
B	濃縮清洗液足夠稀釋至1250ml	125ml 濃縮液
D	鏈霉素過氧化酶結合物（SA-POD）足夠稀釋至14ml	0.7ml 濃縮液
E	底物液（3,3´,5,5´- Tetramethylbenzidin）	15ml 備用
F	終止液（0.25M 硫酸）	12ml 備用
G	鏈霉素過氧化酶結合物稀釋液	15ml 備用
H	GAD₆₅-生物素	3瓶凍干粉
J	GAD₆₅-生物素稀釋液	2 x 15ml 備用，紅色
C I	陰性質控	0.7ml 備用
C II	陽性質控濃度見手冊	0.7ml 備用
1 - 5	標準品濃度見手冊	5瓶， 0.7ml / 瓶備用

所需材料

- 的移液器 10 - 100 µl

- 多道移液器

- 可棄移液頭

- 8腔道清洗器或微盤清洗機

- 濾光波長為450nm及620nm或690nm的酶標儀

- 量筒

- 蒸餾水或去離子水

- 吸水紙或紙巾

- 薄片

規格和保存

谷氨酸脫脫羧酶抗體診斷試劑為96人份檢測試劑。可檢測40份未知樣本以及雙孔標準品和質控血清。

每一個組分的有效日期標示于各自的標簽上，試劑盒的有效期標示于盒簽上。

試劑盒的所有組分必須保存在2-8^oC, 建議放入原始的試劑盒內保存。

使用前的試劑制備

試驗前請將樣本恢復到室溫。小心地輕輕晃動血清樣本，使其混合均勻。

請小心的處理下列組分:

微孔盤（A）- 在打開微孔盤之前使其恢復室溫。沒有使用的盤子應該保存在冰箱內，并且要保存在原包裝袋中封閉好，以避免濕氣，如此可保存16周。

濃縮清洗液（B）– 配制充足用量的洗液，用去離子水或蒸餾水按照1+9（濃縮洗液B+水）的比例稀釋洗液。例如：50ml的濃縮洗液（B）+450ml的蒸餾水。稀釋前的洗液不應該有結晶，否則用37^oC溫水將其溶解。稀釋后的洗液可在2-8^oC保存30天。

鏈霉素過氧化酶（D） – 配制充足用量的鏈霉素過氧化酶溶液，用鏈霉素過氧化酶結合物稀釋液G按照1+19（濃縮酶結合物D+稀釋液G）的比例稀釋。例如：0.25ml濃縮鏈霉素過氧化酶（D）+4.75ml稀釋液（G）。配制好的溶液在2-8^oC穩定16周。

底物液（E） – 底物液（E）避光保存。

GAD₆₅-生物素（H）– 配制充足用量的GAD₆₅-生物素溶液，在試驗前用5.5mlGAD₆₅-生物素稀釋液（J）直接加入到1瓶凍干的GAD₆₅-生物素（H）中。配制好的溶液在2-8^oC穩定3天。

試驗步驟

建議作雙孔重復測試

1. 根據試驗安排將下列液體加入相應孔中。

- 25 µl 陰性質控品（C I）和各標準品（1 - 5）

- 25 µl 病人樣本和質控血清（C II）.

2. 將盤子覆蓋，放置室溫（18 - 25 °C）溫育 60分鐘，同時震蕩，振速>500rpm.

3. 吸去孔內液體或將盤子快速反扣在吸水紙上倒空液體，以除去孔內的殘留物。用300ul

稀釋后的清洗液洗3次，每次浸泡5秒鐘。

4. 每孔加入100ul重組的GAD₆₅-生物素溶液。

5. 將盤子覆蓋，放置室溫（18 - 25 °C）溫育60分鐘，同時震蕩，振速>500rpm.

6. 吸去孔內液體或將盤子快速反扣在吸水紙上倒空液體，以除去孔內的殘留物。用300ul

稀釋后的清洗液洗3次，每次浸泡5秒鐘。

7. 每孔加入100ul稀釋后的鏈霉素過氧化酶結合物溶液。

8. 將盤子覆蓋，放置室溫（18 - 25 °C）溫育20分鐘，同時震蕩，振速>500rpm.

9. 吸去孔內液體或將盤子快速反扣在吸水紙上倒空液體，以除去孔內的殘留物。用300ul

稀釋后的清洗液洗3次，每次浸泡5秒鐘。

10. 每孔加入100ul底物液（E），輕微震蕩。

11. 室溫避光孵育20分鐘。

12. 每孔加入100ul終止液（F）。振蕩5秒，振速>200rpm.

13. 加入終止液后5分鐘內，以雙波長450/620nm或450/690nm測量吸光度。

請注意清洗步驟是十分關鍵的。不充分的清洗將會導致精密度下降和不真實的吸光度評估數值。如果沒有振蕩，測得的吸光度值將會下降20%，并且會降低敏感度。

數據處理

標準曲線是通過將測量所得的1-5個標準品的OD平均值為坐標軸的y軸，將與其相對應的1-5個標準品的濃度設為x軸，由此而得。另外陰性質控品也應該用于此標準曲線的建立。（見下）

根據測得的吸光度值，質控品和未知樣本中所含的GAD₆₅抗體的濃度（IU/ml）可以直接的從標準曲線獲得。

本試驗結果分析也可以通過計算機分析軟件利用spline半對數曲線獲得.

典型實例

請不要用此數據進行試驗評估

樣本	OD （a） 450 nm	OD （b） 450 nm	OD （均值）	IU / ml

陰性質控（C1）	0.145	0.121	0.133	1
標準品1	0.244	0.283	0.264	5
標準品2	0.351	0.391	0.371	15
標準品3	0.684	0.740	0.712	35
標準品4	1.765	1.868	1.817	100
標準品 5	3.397	3.702	3.550	250
陽性質控（CII）	---	---	---	---
樣本 1	0.850	0.857	0.854	41.8

標準曲線

典型實例

參考值

anti-GAD
陰性	< 5.0 IU/ml
陽性	³ 5.0 IU/ml

正如我們通常建立其它的診斷參數那樣，對于anti-GAD₆₅的血清抗體水平監測，建議每一個實驗室也要建立自己的正常范圍及病理學范圍。因此，上面給出的參考值范圍僅僅提供一個指導。

*的試驗數據

標準

Madipan生產的谷氨酸脫羧酶抗體酶聯免疫法檢測試劑的標準依照WHO的參照制定方法NIBSC 97/550條，GAD₆₅抗體的濃度單位為IU/ml.

線性

依據自身抗體人群的不同特質以及考慮到抗原決定簇對自身抗體的特異性和親和力，在一些情況下，用陰性人血清稀釋GAD₆₅抗體后測得的濃度與理論上所期待的濃度不相符。

特異性和敏感度

使用GAD₆₅抗體濃度為5 IU/ml的臨界值（cut-off）測量所得敏感度為92.3%，特異性為98.6%，此濃度顯示病人為新近感染I型糖尿病。

檢測限制

分析敏感度（檢測下限為0 ± 3 SD）為0.8 IU/ml.

以4 IU/ml的濃度測量功能性敏感度的盒內CV值為20%。

盒內差和盒間差

盒內差			盒間差
樣本號	濃度均值（IU/ml）	CV （%）	樣本號	濃度均值（IU/ml）	CV （%）
1	16	4	5	5	14
2	60	4	6	42	7
3	151	4	7	99	3
4	256	3	8	237	25

方法學限制

用本谷氨酸脫羧酶抗體（anti-GAD）檢測試劑對健康人群進行檢測，結果應該為陰性。但是，anti-GAD可能也出現在外表上健康的人體內。

在極少數神經紊亂的患者中，約60%的Stiff-man綜合征患者的血清中有GAD₆₅抗體。與I型糖尿病患者體內的GAD₆₅抗體比較，來自SMS患者體內的GAD₆₅抗體有很高的效價。因此來自疑似SMS患者的GAD₆₅抗體應該用陰性血清預稀釋1：50或1：100倍。SMS疾病患者的GAD₆₅抗體也會出現的腦脊髓液中。

任何臨床確診都不應該建立在單獨的體外診斷方法的基礎上。醫生應該考慮所有的臨床的和試驗室的檢查結果，然后才能夠確診。

試驗安排表

請將所有的試劑組份恢復室溫，輕微振蕩使其混合均勻。

順序	步驟	材料	詳情
1	加樣各樣本		質控I 25 µl	質控 II 25 µl	檢測病人樣本 25 µl
2	孵育微孔盤室溫放置一小時，同時振蕩（ > 500 rpm ）
3	吸液或倒出		微孔盤反扣于吸水紙上
	清洗	清洗溶液	3 x 300 µl	3 x 300 µl	3 x 300 µl
4	加樣	GAD₆₅-生物素溶液	100 µl	100 µl	100 µl
5	孵育	微孔盤	室溫放置一小時，同時振蕩（ > 500 rpm ）
6	吸液或倒出		微孔盤反扣于吸水紙上
	清洗	清洗溶液	3 x 300 µl	3 x 300 µl	3 x 300 µl
7	加樣	鏈霉素過氧化酶結合物溶液	100 µl	100 µl	100 µl
8	溫育微孔盤室溫放置20分鐘，同時振蕩（ > 500 rpm ）
9	吸液或倒出		微孔盤反扣于吸水紙上
	清洗	清洗溶液	3 x 300 µl	3 x 300 µl	3 x 300 µl
10	加樣	底物液	100 µl	100 µl	100 µl
11	孵育	微孔盤	室溫放置20分鐘，避光
12	加樣和混合	終止液	100 µl	100 µl	100 µl
13	測量吸光度		請于5分鐘內在波長450 / 620 nm 或450 / 690 nm下測讀

安全注意事項

本試劑于體外使用。請仔細遵照使用說明書。

請注意各組分標簽上的有效日期。同樣請注意重組試劑的穩定性說明。

不要混合或使用不同批號的試劑。

不要使用來自其它廠商的試劑

加試劑時避免時間差。

不使用時，所有試劑組分都應該在原包裝內保存在2 - 8 °C。

在一些試劑中含有少量的（< 0.1 % w/w）疊氮鈉作為防腐劑。請不要吞咽或接觸皮膚及粘膜。

在試劑制備中所使用的來自人體血液或組織的原材料已經被檢測，結果為HBsAg陰性，HIV陰性和HCA抗體陰性。但是，沒有試驗能夠保證此類病毒的存在。因此請按照潛在的危險品來處理所有試劑組分和樣本。

由于試劑包含潛在的危險物質，請遵守以下注意事項：

- 當處理試劑材料時請不要吸煙、吃或喝食品。

- 戴防護手套

- 不要通過嘴來吸液。

- 快速擦干溢出物，用消毒劑擦拭受污染的表面。

任何情況下，使用本試劑時都要遵守所有GLP規定以及本試劑的*規定。